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由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度要求較高，不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)或產(chǎn)生“偽峰”。此外，溶劑的極性也要與待測樣品、檢測器匹配等等。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會使柱子惡化。那么，我們在HPLC溶劑選擇的時候，需要遵循哪些原則呢？

參考下表常用溶劑在不同波長下的吸收值：

1、流動相溶劑的選擇：流動相溶劑的正確選擇對于高效液相色譜分析(HPLC)的成功與否非常重要。目前還沒有一個較為理想的選擇模式，主要依賴于經(jīng)驗的積累。

流動相溶劑選擇的一般要求是： (1)溶劑應(yīng)當(dāng)是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性；(2)溶劑的性能與使用的檢測器應(yīng)當(dāng)匹配；(3)溶劑對樣品應(yīng)有足夠的溶解能力；(4)溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c；(5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑。在選擇流動相溶劑時，可以從影響分離度R 的因素即柱效、分離因子a和容量因子來考慮。選擇溶劑時首先應(yīng)排除一些物理性質(zhì)(如沸點、粘度、紫外吸收等)不適于在液相色譜中使用的溶劑，然后選擇能使分析樣品中組分的容量因子值保持在1～1O之間、洗脫強(qiáng)度適當(dāng)?shù)娜軇嘟M分的樣品、值可擴(kuò)展在0.5～20之間。在選出適用值的溶劑當(dāng)中，還要進(jìn)一步選擇能將樣品中的不同組分分離開、且能使每個相鄰組分的分離因子a大于1.05的溶劑。所選擇的適用Ic，和a的溶劑還必須與能提供高理論塔板數(shù)的色譜柱相組合。因此，作為一個色譜工作者，熟悉表征溶劑物理和化學(xué)特性的重要參數(shù)，如溶劑強(qiáng)度參數(shù)￡、溶解度參數(shù)δ、極性參數(shù)P、粘度η等，對液相色譜法流動相溶劑的選擇會起到十分重要的作用。
 
能夠作為液相色譜流動相使用的溶劑有100多種，但實用的溶劑只有少數(shù)幾種。在實驗室中有了甲醇、乙腈、水、四氫呋喃、正己烷、二氯甲烷，就能夠解決9O％以上的色譜分離問題。

 2、溶劑的處理和更換：液相色譜溶劑應(yīng)盡量使用HPLC級溶劑。HPLC級試劑是用特殊方法生產(chǎn)的含有最少的微粒和的紫外吸收物質(zhì)。水也應(yīng)達(dá)到HPLC級。液相色譜實驗室應(yīng)配有純水發(fā)生器。非色譜純?nèi)軇┛赏ㄟ^蒸餾方法進(jìn)行提純，除掉大部分有紫外吸收的雜質(zhì)。另外，用氧化鋁或硅膠柱可除去極性強(qiáng)的化合物。

理論上，由HPLC級溶劑組成的流動相不濾（但因操作過程中，因溶劑本身，容器、環(huán)境等原因，建議在進(jìn)入系統(tǒng)使用前使用相應(yīng)的濾膜進(jìn)行過濾操作），其他溶劑由于含有不溶性微小顆粒，會逐漸堆積在色譜柱中堵塞流動相的通道，使柱壓力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0.2～0.5um 的過濾器過濾。當(dāng)使用固體化學(xué)試劑(如緩沖鹽)配制流動相時過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵的單向閥、阻塞、損壞進(jìn)樣器和柱頭過濾片?，F(xiàn)有過濾器有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇。過濾水溶性流動相時(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。

流動相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理(連同貯液器一起脫氣效果更好)， 以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。若在死體積檢測池中，存在氣泡會增加基線噪聲，嚴(yán)重時會造 成分析靈敏度下降。流動相中的氧氣對光電檢測器影響，使紫外檢測器基線增高，低波長檢測時信號被抵消掉。在熒光檢測中O2會使樣品的熒光淬滅，降低靈敏度，還會導(dǎo)致某些組分被氧化或使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有① 氦脫氣；② 加熱回流；③ 真空脫氣；④ 超聲波脫氣。從脫氣速度和效果看，加熱回流法，但操作不方便，存在著火的危險。對于混合流動相不提倡用此法，因為揮發(fā)性組分會損失掉，改變流動相的組成。超聲脫氣法只能除去3O 的溶解氣體效果最差。近年來新出現(xiàn)的在線真空脫氣法(on—line degasser)，把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過濾器，實現(xiàn)了流動相在進(jìn)人前的連續(xù)脫氣。其脫氣效果明顯優(yōu)于上述4種方法，并適用于多元溶劑體系。

在HPLC中需要經(jīng)常更換新溶劑。更換溶劑時，必須將原有的溶劑沖洗干凈。如果新舊溶劑是互溶的，則必須保證新溶劑使色譜柱重新達(dá)到平衡。否則將產(chǎn)生基線漂移。若新舊溶劑不互溶，則要選擇與原溶劑和新溶劑(正相和反相)都相溶的過渡溶劑沖洗，然后再用新溶劑沖洗。如異丙醇是1種很理想的過渡溶劑。特別要注意防止新舊溶劑發(fā)生反應(yīng)或生成沉淀物，否則將給管路、泵及檢測器帶來污染和堵塞，給清洗工作帶來麻煩。

如果緩沖液反相流動相被正相流動相所污染，產(chǎn)生緩沖鹽沉淀，可用5倍柱體積的非緩沖液反相流動相沖洗系統(tǒng)，再用10倍柱體積的強(qiáng)溶劑(如乙腈)通過系統(tǒng)，最后用50倍柱體積的異丙醇沖洗系統(tǒng)，以除去所有滯留的流動相和溶劑殘留，換上反相流動相沖洗，使系統(tǒng)重新平衡。如果正相流動相被水溶性溶劑所污染，先用50倍柱體積的異丙醇沖洗，而后用正相流動相沖洗。在分析樣品前，最少需用10倍體積的最終流動相沖洗系統(tǒng)。

3、溶劑與檢測器的匹配：在使用紫外可見光檢測器時，需選用無紫外吸收特性的溶劑作流動相。樣品測定波長應(yīng)當(dāng)在溶劑紫外吸收波長上限以上，噪聲降至10-4 ～ 10-5AU，才能保證檢測的靈敏度，才能用于梯度洗脫。流動相溶劑在整個梯度范圍內(nèi)互溶性要好，盡量減少溶劑折光指數(shù)對溶劑組成梯度的影響。溶劑折光指數(shù)的改變會導(dǎo)致紫外吸收度的變化，使紫外檢測器產(chǎn)生噪音和漂移。因此，當(dāng)使用兩種或兩種以上溶劑做梯度時，其折光指數(shù)應(yīng)該盡量接近，盡量減少溶劑紫外吸收度改變的影響。
 

在使用示差折光檢測器時，應(yīng)使流動相的折光指數(shù)與被測樣品的折光指數(shù)有盡可能大的差別，因為二者的折射率差別越大，檢測器的響應(yīng)信號越大，檢測靈敏度越高。示差折光檢測器一般不用于梯度洗脫，這是因為隨溶劑組成的改變，流動相的折光指數(shù)也在改變，無法使基線穩(wěn)定。

使用熒光檢測器時，不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動相。溶劑的極性和溶液的溫度對熒光強(qiáng)度有明顯的影響。增大溶劑的極性，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通常熒 光物質(zhì)溶液的熒光效率和熒光強(qiáng)隨著溫度的升高而降低。此外，當(dāng)樣品濃度較高時，易引起熒光猝滅效應(yīng)和內(nèi)濾效應(yīng)，溶液濃度越大，該效應(yīng)越顯著，溶液中的其它 成分，特別是順磁性物質(zhì)的存在，將使猝滅效應(yīng)加劇。因此，在進(jìn)行熒光檢測時，試樣要配成低于10-6 g／mL濃度的溶液，要使用不含熒光物質(zhì)的溶劑。

電化學(xué)檢測器所用的流動相必須具有導(dǎo)電性。安培檢測器采用的流動相中必須有常用濃度范圍為0.01 mol／L-0.1 mol／L電解質(zhì)(如含鹽的緩沖液)存在。流動相要有足夠高的介電常數(shù)，使電解質(zhì)充分解離。流動相在電極表面呈電化學(xué)惰性，工作電壓下背景電流小。

為什么乙醇、丙醇、丙酮不被用做流動相？研究表明，當(dāng)流動相的A>0.7的時候，基線噪聲會顯著增加，一般選擇的吸收值<0.5。當(dāng)A>1.0時，基本就不能用使了。對于示差折光檢測器，主要考慮樣品和流動相的折光率，選用的溶劑粘度要低、沸點適中使用低粘度溶劑，可減小容質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱效。從分離制備和色質(zhì)連用考慮，沸點要適中，低沸點的溶劑有它的優(yōu)點;但僅僅用 于分析，沸點太低，反而由于溶劑的揮發(fā)，造成保留時間的變化。盡量不用高毒性的溶劑不只是環(huán)境，單從我們自身的安全考慮，當(dāng)然用低毒溶劑。溶劑對樣品有足夠的溶解力樣品如果不能溶解在選用的溶劑里，還怎么分析? 但如果樣品在流動相里溶劑仍然不大，可以用樣品的溶劑先溶解，再用流動相稀釋，就可以了。知道了上面選擇溶劑的一般原則，就不難理解為什么不同乙醇、丙醇做流動相的原因了，因 為它們的粘度大。 還有丙酮，雖然粘度和毒性較低、溶解度大、極性適中，但用于它的截至吸收波長為330nm， 所以不常用，如果樣品的吸收大于330nm，其實用丙酮是一個不錯的選擇。
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