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1、哪種柱子可以反沖，哪種不可以?反沖后是正著用，還是反著用？

答：一般的正相、反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。

2、方法開發(fā)的時(shí)候，用乙腈和水作為流動(dòng)相，在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，剛開始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調(diào)到40%乙腈，RT沒有變化，30%也沒有變化，一直調(diào)到20%的時(shí)候，RT突然變到了約13分鐘，請(qǐng)問什么原因（用的是離子交換柱）？

答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單，需要把你的方法說的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?對(duì)于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?

3、對(duì)于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么?

答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過程，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽，尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。如果要加快平衡時(shí)間，把前面用來平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡，目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。

4、如果柱子長(zhǎng)時(shí)間不用，需要如何儲(chǔ)存?

答：對(duì)一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。

5、什么原因?qū)е路灞仍瓉泶螅页霈F(xiàn)的早?

答：過快、過大的峰通常是由于從分流口和隔墊吹掃口排出的載氣減少，而更多的進(jìn)入色譜柱;因此增加柱頭壓力，可降低分流比。檢查分流出品的氣體流量，如需調(diào)整分流比則對(duì)調(diào)整此流量。如果問題依然存在，可卸下并清潔分流口。這個(gè)問題也可能由于柱頭壓調(diào)節(jié)閥有問題而引起。

6、預(yù)柱或保護(hù)柱是不是必需？安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎?

答：加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在，但是如果保護(hù)柱接得好，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。

7、何時(shí)需更換隔墊或襯管?

答：通常比較好的隔墊至少能保證100次進(jìn)樣不發(fā)生問題。當(dāng)色譜特征說明襯管有問題時(shí)，需要更換襯管。影響隔墊壽命的因素有注射器尺寸、進(jìn)樣口溫度和壓力，當(dāng)然受壓力影響的程度比較小。影響襯管壽命的因素通常是樣品的清潔度。應(yīng)該根據(jù)儀器維護(hù)歷史記錄來選擇色譜需要的特定程序。

8、Atlantis C18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù)：流動(dòng)相中不含緩沖鹽分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min流動(dòng)相中含有緩沖鹽，分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易長(zhǎng)菌，使用時(shí)間不可超過3天);水性柱保存體系也不特別：短期保存在所用的流動(dòng)相中(不含緩沖鹽)，中長(zhǎng)期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。

9、正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?

答：短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。

10、同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前?

答：色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后，保留時(shí)間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì)，還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜，有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后。不過你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候，注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個(gè)分析方法用專門的色譜柱，長(zhǎng)遠(yuǎn)看，這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用。

11、怎么通過選擇合適的柱子來提高分離度?

答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來考慮，柱效、選擇性和保留因子。可通過減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性;有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子，也可提高分離度。

12、流動(dòng)相走空了，液相色譜柱還能用嗎?如果可以應(yīng)該如何再生?

答：能用的!可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去，但之后多用流動(dòng)相沖沖，看到基線穩(wěn)定，就沒問題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗，然后再檢測(cè)一下柱效，看柱子是否恢復(fù)，液相設(shè)置一下壓限，這樣就不怕流動(dòng)相而會(huì)損傷色譜柱。

13、如何改善峰形?(前伸峰、拖尾峰)

答：前伸峰是由于色譜柱過載。當(dāng)一種或多種化合物的進(jìn)樣量超過色譜柱固定相容量時(shí)，可能發(fā)生這種情況。液相膜越薄，色譜柱中保留的每種化合物就越少。這涉及到進(jìn)樣體積和進(jìn)樣中每個(gè)峰的化合物濃度。通過減少進(jìn)樣量、分流樣品或進(jìn)樣濃度較低的樣品，可減小進(jìn)樣體積。

14、氨基柱時(shí)，有時(shí)候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時(shí)間就又好了，什么原因，如何再生?如果可以沖的話，一般沖多久?

答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高(大約有1mol/L)，在有水存在的時(shí)候，在孔內(nèi)形成一個(gè)pH10左右甚至超過10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境，并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基，又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程。一段時(shí)間后，兩個(gè)相反的過程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來。對(duì)你問題提到的這個(gè)現(xiàn)象，我想到的是這個(gè)原因。

氨基柱，要看氨基柱的應(yīng)用模式，是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式應(yīng)用，一般流動(dòng)相是乙腈/水，是不怕水的。不過鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí)，流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水，但清洗柱子上的污染物質(zhì)，是可以含水的，因?yàn)樗袕?qiáng)極性，在正相色譜上洗脫能力，當(dāng)然不99%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。

15、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會(huì)對(duì)柱子有什么損壞嗎?pH在2左右。

答：pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對(duì)更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動(dòng)相中，也不份擔(dān)心，最多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點(diǎn)，保存期間水分揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對(duì)柱子損傷很大。

16、色譜柱的安裝有什么技巧?還有所謂的死體積怎么測(cè)定呢?

答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實(shí)擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是不保留的物質(zhì)出峰時(shí)從進(jìn)樣到流過色譜柱的總體積，一般用極性非常強(qiáng)的的出峰來測(cè)定。死體積包括柱體積(色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積)和柱外體積兩部分。你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長(zhǎng)度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否，保護(hù)柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對(duì)這個(gè)有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴(kuò)散外，還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外，那就只有擴(kuò)散這個(gè)使柱效下降的因素了。

所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成(包括添加劑)、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響。另外測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。

17、柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會(huì)有什么不良后果?

答：不建議將柱篩板拆下清洗，因?yàn)椴鹣鲁袎旱闹Y板會(huì)導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對(duì)污染的色譜柱行清洗維護(hù)，維護(hù)沒有效果，再把拆洗柱篩板作為最后的手段。

18、CN基柱應(yīng)該怎樣維護(hù)才好呢?比如做完實(shí)驗(yàn)用什么流動(dòng)相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長(zhǎng)期用什么溶劑保存等等。

答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護(hù)辦法和一般正相和反相柱沒有多大區(qū)別。

19、色譜分析運(yùn)行時(shí)，標(biāo)樣和樣品的峰均隨時(shí)間加寬

答：如果保留時(shí)間沒有很大區(qū)別，只是加寬的峰拖尾，可能表明有活化點(diǎn)。如果加寬的峰是對(duì)稱的，可能是由于正常的色譜柱“損耗和流失”。如果峰前伸，說明色譜柱過載。

20、排除色譜柱流失問題的方法是什么?

答：診斷色譜柱是否存在流失問題的方法是次在方法條件下安裝色譜柱時(shí)，做一次空白色譜圖，然后將最近的運(yùn)行和空白運(yùn)行色譜圖對(duì)比。如果在空白運(yùn)行中產(chǎn)生了很多峰，則色譜柱性能改變，這可能是由于載氣中含有氧氣，也可能是由于樣品殘留。如果有GC-MS，則低極性色譜柱的典型流失離子(例如DB/HP-1或5)質(zhì)/荷比m/z將為207、73、281、355等，大多數(shù)為環(huán)硅氧烷。

21、請(qǐng)問我做一種藥的分析，查美國藥典規(guī)定使用100mm×40mm8μm色譜柱，流速3mLmin?？涩F(xiàn)在市場(chǎng)上已不容易找到這種規(guī)格的產(chǎn)品，于是我按USP中色譜柱比較的數(shù)據(jù)庫的指引，選了一款選擇性一致的等價(jià)色譜柱，其規(guī)格是100mm×46mm3μm的色譜柱，當(dāng)選用3mLmin的流速時(shí)發(fā)現(xiàn)柱壓超高，請(qǐng)問我如何對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整以滿足USP的要求?

答：流速調(diào)整原則是流動(dòng)相通過柱子的線速度一致，等價(jià)柱的截面積大了，流速也應(yīng)增加才能保持相同的線速度。新流速計(jì)算結(jié)果是：(4.6/4.0)2x3.0=4.0ml/min。但3ml/min流速都已導(dǎo)致柱壓太高，4.0ml/min明顯不行。好在USP還有個(gè)允許±50%的流速調(diào)整指導(dǎo)原則，這樣將流速調(diào)至2.0ml/min既符合USP規(guī)定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。這個(gè)例子中，等度分析中，流速改變會(huì)引起塔板數(shù)和峰寬的改變，但不會(huì)影響峰的選擇性。3um粒徑色譜柱柱效比8um的高很多，可考慮縮短柱長(zhǎng)以補(bǔ)償或部分補(bǔ)償流速降低造成的測(cè)定時(shí)間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運(yùn)行，可以在符合USP規(guī)定的情況下，又得到更快速的測(cè)定分離。

22、最近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿意的結(jié)果。有人建議我對(duì)色譜條件，如進(jìn)樣量、流動(dòng)相pH和溫度等，進(jìn)行微調(diào)以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規(guī)定我不能這樣做，怎么辦?

答：如果你心里老有這個(gè)思維定勢(shì)“按規(guī)定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦!只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結(jié)果，你才能發(fā)現(xiàn)問題所在。如果改變條件后，仍得不到好結(jié)果，就要去找色譜條件以外的原因，如色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過程中的是否存在問題?不管通過微調(diào)你是否取得了好結(jié)果，你也有了向匯報(bào)問題和解決方案的依據(jù)。而且，不能調(diào)整藥典規(guī)定色譜條件的說法通常是不對(duì)的。美國藥典USP說的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗(yàn)證，但方法調(diào)整或者稱微調(diào)以符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗(yàn)證的。USP列了調(diào)整的幾條指導(dǎo)原則，如±50%的流速調(diào)整，±10℃的溫度調(diào)節(jié)等等(詳見"Chapter 621，Chromatography，" United States Pharmacopeia No. 31-NF 26， (2008).)。當(dāng)然既然是指導(dǎo)原則，這些規(guī)定都不是的，如溫度調(diào)整±10℃，對(duì)有些方法適用，對(duì)另外的方法則±5°C的調(diào)整都會(huì)有問題，我們應(yīng)該依據(jù)具體情況作出明智的科學(xué)判斷。

23、峰形后拖尾是什么原因造成的?

答：[柱物理損壞] 色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。的解決方法就是更換新柱。

[柱內(nèi)填料污染] 流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純?cè)噭?。流?dòng)相所用的水是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45um溶劑微孔過濾(器)過濾，除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。

復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過濾(器)或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)。或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積，或視具體情況而定;另外，此時(shí)不能接檢測(cè)器)，將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。

[柱進(jìn)口處有異物] 當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。

[樣品濃度過高致使柱超載] 樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾(或伸舌)。適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度(需要時(shí)，可提高檢測(cè)器靈敏度)直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50ug范圍內(nèi)，不會(huì)引起明顯超載。

[樣品溶劑不對(duì)] 選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾。選用流動(dòng)相溶解樣品。

[柱外效應(yīng)]即進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過長(zhǎng)、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積，是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。

[緩沖不足或不合適] 在緩沖不好或離子強(qiáng)度過低的分離中，也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。

[硅醇基團(tuán)作用] 仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用，以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中，效果會(huì)顯著。

[柱內(nèi)金屬污染] 柱內(nèi)金屬污染(Fe，Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動(dòng)相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對(duì)稱的。

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