PCR儀反應(yīng)類型中是用于核酸定量的的測定法，并且是分子生物學(xué)的大多數(shù)領(lǐng)域中的主要選擇方法。雖然存在不同類型的QPCR定量，但確定擴(kuò)增效率應(yīng)該是建立qPCR測定時要做的首要任務(wù)，了解效率以及如何計算效率對于準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要。
理想地，靶序列的分子數(shù)應(yīng)在每個復(fù)制周期期間加倍，對應(yīng)于100％的擴(kuò)增效率。同樣如果復(fù)制分子的數(shù)量少于兩倍，這是由于效率低于100％。效率較低的常見原因是糟糕的引物設(shè)計和非試劑濃度，或反應(yīng)條件。二級結(jié)構(gòu)，如二聚體和不適當(dāng)?shù)娜刍瘻囟龋瑫绊懸锬０逋嘶?，?dǎo)致擴(kuò)增不良，由于每個額外的稀釋液含有適當(dāng)較低的DNA起始量，因此在連續(xù)稀釋的樣品中Ct值之間存在差異。
擴(kuò)增效率超過100％，其主要原因是聚合酶抑制。即使向試劑混合物中添加更多模板，Ct值也可能不會轉(zhuǎn)移到更早的循環(huán)，這使效率曲線變平，導(dǎo)致斜率降低，放大效率超過100％。聚合酶的抑制劑包括樣品中過量的DNA，RNA或殘留物質(zhì)。常見污染物包括肝素，血紅蛋白，多糖，葉綠素，蛋白酶K，乙酸鈉等。其他各種也可以從DNA，RNA分離步驟轉(zhuǎn)移，如乙醇，和十二烷基硫酸鈉。如果濃縮樣品中存在抑制劑，則與不含抑制劑的樣品相比，需要更多的循環(huán)來超過檢測閾值，在更濃縮的樣品中更可能發(fā)生抑制，并且改善曲線斜率的一種方法是通過稀釋樣品。
即使在起始試劑混合物中存在更多模板，由于抑制，Ct值也可能不會相應(yīng)地移位，這使效率圖變平，導(dǎo)致較低的斜率和超過100％的擴(kuò)增效率?？梢酝ㄟ^使用高度稀釋的樣品來避免這種假象。如果發(fā)生抑制，則在計算效率時應(yīng)將濃縮樣品排除在分析之外 。類似地，由于隨機(jī)效應(yīng)，在高變異性的情況下也應(yīng)省略大多數(shù)稀釋樣品。
PRC儀在進(jìn)行多次qPCR檢測時，通過在qPCR之前用分光光度測量法分析DNA樣品的純度，可以容易地避免抑制。純度測量為260和280nm處吸光度值的比率，其對應(yīng)于核酸與其他分子的比率。如果DNA的純度分?jǐn)?shù)不高于1.8或RNA不高于2.0，則應(yīng)純化樣品。也可以使用不同的樣品制備方法。如果額外的純化步驟不能解決問題，則樣品可能難以使用。在這種情況下，可以考慮更好地耐受抑制劑的qPCR主混合物。
文章來源：上海靳瀾儀器制造有限公司/pcr/index.html
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